2.2測(cè)定細(xì)胞雕亡的方法

加溫引起細(xì)胞周期阻滯并引發(fā)細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞的定性和定量測(cè)定可以作為評(píng)定細(xì)胞熱效應(yīng)的客觀指標(biāo)。

2.2.1  光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡

凋亡細(xì)胞的組織學(xué)變化表現(xiàn)為：只發(fā)生在單個(gè)細(xì)胞或幾個(gè)細(xì)胞而周圍細(xì)胞是完好無損的并無炎癥反應(yīng)表現(xiàn)。在光學(xué)顯微鏡下凋亡細(xì)胞最主要的變化是核內(nèi)染色質(zhì)的濃縮，形成染色質(zhì)塊，并貼在核的邊緣，呈現(xiàn)月牙形或沙丘狀。進(jìn)一步則呈分葉狀或花瓣?duì)睿�最后分離形成多個(gè)核碎片。細(xì)胞胞質(zhì)固縮，體積縮小，細(xì)胞表面起泡，成不規(guī)則形狀。凋亡小體出現(xiàn)，并可見凋亡小體被周圍巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。通過計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，可以計(jì)算凋亡指數(shù) ( apoptotic index )。

2.2.2  流式細(xì)胞分析法

流式細(xì)胞術(shù)（ FCM, flow cytometry ）是對(duì)單細(xì)胞多項(xiàng)特征進(jìn)行快速測(cè)定的生化技術(shù)。其原理為：經(jīng)過特異的熒光染料染色的單細(xì)胞懸液受到一束預(yù)定波長的激光照射時(shí)可以發(fā)出熒光，熒光的強(qiáng)度與所染物質(zhì)的量成正比，因此，測(cè)出熒光強(qiáng)度即可得知所測(cè)物質(zhì)的相對(duì)含量，若將受激產(chǎn)生的熒光，經(jīng)光電倍增管接收放大，并送電子計(jì)算機(jī)處理即可得出所需參數(shù)。細(xì)胞經(jīng)DNA熒光染料（如碘化丙啶）標(biāo)記后，F(xiàn)CM可測(cè)定單個(gè)細(xì)胞DNA含量，經(jīng)電子計(jì)算機(jī)處理可得出細(xì)胞群DNA含量的分布圖，亦稱細(xì)胞周期直方圖（見圖3.2.1），直方圖的橫坐標(biāo)表示DNA含量，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞出現(xiàn)的頻率，即相對(duì)細(xì)胞數(shù)。左邊第一峰是由G1和G0細(xì)胞組成，右邊小峰由G2和M期細(xì)胞組成，中間部分是S期細(xì)胞。如果在G1峰前出現(xiàn)Sub-G1峰，它是由帶有DNA降解的凋亡細(xì)胞組成。經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理可計(jì)算出G0/G1、S、G2/M各細(xì)胞周期細(xì)胞所占比例和Sub-G1凋亡細(xì)胞的比例（見表3.2.1）。

將細(xì)胞消化后離心，沉淀后用70%冰乙醇固定，于40C下過夜，離心，用PBS液洗2遍，加RNA酶(50ug/ml)、370C作用１小時(shí)，再用PI溶液（100ug/ml)染色DNA 30分鐘，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。

2.2.3  DNA片段化分析法 ( DNA ladder )

細(xì)胞凋亡的最后通路是細(xì)胞染色質(zhì)DNA特征性的片段化降解。細(xì)胞發(fā)生凋亡，其DNA的降解不是隨機(jī)位點(diǎn)上發(fā)生斷裂，而是在兩個(gè)核小體 ( nucleosome ) 之間的連接部位發(fā)生斷裂。所以這些DNA片段就是在形態(tài)學(xué)上出現(xiàn)若干大小不一的由180個(gè)堿基對(duì)的整倍數(shù)的寡核苷酸片段組成。因此，從發(fā)生細(xì)胞程序化死亡的細(xì)胞中提取染色體DNA，進(jìn)行瓊脂糖 ( agarose ) 凝膠電泳時(shí)，能觀察到呈不連續(xù)但具有特定大小的條帶狀，稱為云梯 ( ladder ) 狀。這是細(xì)胞程序化死亡最重要的生物化學(xué)特征之一，也是DNA片段化分析法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理。該法是先用酸或氯仿提取DNA，再用乙醇沉淀，在明膠板上進(jìn)行電泳后，用溴化乙錠著色，出現(xiàn)特征性的DNA梯形條帶。此法敏感性不高，需要106個(gè)以上細(xì)胞。

2.2.4 原位末端標(biāo)記檢測(cè)凋亡效應(yīng) ( TUNEL 分析 )

這是一種對(duì)單個(gè)細(xì)胞通過顯示DNA的降解來檢測(cè)凋亡的技術(shù)，屬于原位末端標(biāo)記技術(shù)（ in situ end labeling techniques, ISEL ）中的一種。該法是對(duì)細(xì)胞經(jīng)甲醇固定處理后，滴加轉(zhuǎn)化劑－POD, 蘇木精復(fù)染，用DNAase I 處理細(xì)胞，使之產(chǎn)生DNA鏈缺口，再滴加TUNEL反應(yīng)混合液。以細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性凋亡細(xì)胞，每張細(xì)胞片選擇3個(gè)區(qū)在300倍視野下連續(xù)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算其中凋亡細(xì)胞的百分率。

第2章           加溫后的生物學(xué)改變

3.2  分子，基因水平

熱療的作用靶是真核細(xì)胞的核染色體具有雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA，產(chǎn)生單鏈斷裂（可修復(fù)）和雙鏈斷裂（不可修復(fù)）。加溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的熱休克蛋白70 ( HSP70, heat shock protein )都有促進(jìn)細(xì)胞損傷修復(fù)的作用；另一方面，加溫也使細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶活性增加，其崩解釋放的消化酶使損傷細(xì)胞蛋白消化溶解。加溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤壞死因子a ( TNFa, tumor necrosis factor )對(duì)細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用。加溫尤其是在高溫下，細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)的聚合酶活性下降，使加溫所致DNA損傷修復(fù)受阻。加溫產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯，由此啟動(dòng)修復(fù)過程，如果細(xì)胞損傷不能修復(fù)，將引發(fā)細(xì)胞程序化死亡過程，即凋亡發(fā)生。P53抑癌基因?qū)�加溫后�?xì)胞周期阻滯和凋亡都起著重要的調(diào)控作用。

P53基因位于人17號(hào)染色體上 （ 17p13.1 ），因編碼一分子量53KD的核磷酸蛋白而得名。P53基因全長約20kb，有11個(gè)外顯子，10個(gè)內(nèi)含子，編碼393個(gè)氨基酸。P53蛋白有三個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)：N－末端為酸性區(qū)，具有轉(zhuǎn)錄激活功能，可與許多轉(zhuǎn)錄因子相互作用；中央疏水區(qū)富含脯氨酸具有序列特異性DNA結(jié)合特性；C－末端是堿性區(qū)，為高活性的關(guān)鍵區(qū)域，易形成a螺旋和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，其寡聚區(qū) （ 第319－360氨基酸殘基）所形成的二聚體或四聚體對(duì)于p53蛋白與系列特異性DNA的結(jié)合而發(fā)揮的反式激活功能具有關(guān)鍵作用。

P53基因的主要功能：一是作為細(xì)胞周期檢查點(diǎn) ( checkpoint ), 起分子警察的作用。即細(xì)胞受損時(shí)，DNA損傷可誘導(dǎo)短時(shí)間p53基因的表達(dá)，p53蛋白可與DNA調(diào)控區(qū)結(jié)合，使CKI基因WAF1/ CIP1( WAF1, wild-type p53 transactivated gene, CIP1, Cdk-interacting protein ) 表達(dá)，其產(chǎn)物為p21蛋白，而p21可抑制細(xì)胞周期蛋白D激酶 （ CDK ）活性，使cyclin-cdk不能磷酸化pRb，從而阻礙了E2F的釋出，使DNA合成的有關(guān)基因不能表達(dá)，使細(xì)胞不能進(jìn)入DNA合成的S期，這樣損傷的細(xì)胞則停滯在G1期，為細(xì)胞DNA的修復(fù)創(chuàng)造條件。P53除了誘導(dǎo)和促進(jìn)G1期阻滯外，還有觀察到對(duì)某些細(xì)胞的G2期阻滯。P53基因的另一重要功能是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞DNA損傷不能修復(fù)時(shí)，p53會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入編程化死亡過程。它可能通過兩種途徑來調(diào)控凋亡：一是通過特異性轉(zhuǎn)錄激活 ( sequence specific transcription activation, SST )方式，p53直接激活死亡基因，如bax，或者抑制存活基因，如bcl-2。Bax 比例上調(diào)，和/或bcl-2比例下調(diào)，均可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。二是p53通過非SST依賴途徑起作用。P53基因?qū)δ[瘤組織有抑制作用，一是它可抑制腫瘤細(xì)胞生長，二是它可抑制腫瘤血管的生成，其機(jī)制可能是p53通過抑制血管內(nèi)皮生長因子 ( VEGF )的作用有關(guān)。

P53基因與腫瘤細(xì)胞的熱敏感性密切相關(guān)。對(duì)于攜帶野生型p53的細(xì)胞，加溫后p53表達(dá)增加，對(duì)加溫引導(dǎo)的凋亡效應(yīng)起促進(jìn)作用，對(duì)于攜帶突變型p53的細(xì)胞，加溫后突變型p53表達(dá)也增加，與加溫產(chǎn)生的熱休克蛋白70協(xié)同，對(duì)加溫引導(dǎo)的凋亡效應(yīng)起減弱作用（7，9）。加溫使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞周期G1期或S期阻滯，并引發(fā)凋亡。具有正常功能的野生型p53可以增強(qiáng)細(xì)胞熱效應(yīng), 使細(xì)胞周期阻滯更延遲和凋亡比例增加，而p53缺失或變異將會(huì)減弱或失去這種作用（4、5、6、7、8、9）。

本作者采用本研究所腫瘤分子生物室構(gòu)建的帶有不同p53狀況的4種人胃腺癌細(xì)胞，即通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的野生型p53基因質(zhì)粒、突變型p53基因質(zhì)粒、和無p53基因的空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)移進(jìn)有p53缺陷的人胃癌BGC－823細(xì)胞中，其中帶有野生型p53 的BGC823-wtp53細(xì)胞 ( 略為W細(xì)胞 )，帶有突變型p53 的BGC823-mutp53細(xì)胞 ( 略為M 細(xì)胞 )，帶無 p53空載質(zhì)粒的BGC823－vect細(xì)胞 （略為neo細(xì)胞）和親本BGC823細(xì)胞 （ 略為823細(xì)胞 ），用于本實(shí)驗(yàn)。用FCM分析加熱42°C，2h或43°C，30min后，在37°C培養(yǎng)下，8h或16h后，4種細(xì)胞的細(xì)胞周期再分布和凋亡的比例，結(jié)果（見圖3.2.1和表3.2.1）顯示在37°C對(duì)照條件下，4種細(xì)胞的細(xì)胞周期各時(shí)相比例都沒有明顯差異。在兩種加溫條件下，在37°C恢復(fù)8h或16h后，只有W細(xì)胞出現(xiàn)強(qiáng)烈的S期阻滯，在16h后出現(xiàn)明顯的預(yù)示凋亡的Sub-G1峰，而其他3種p53異常細(xì)胞的細(xì)胞周期各時(shí)相都沒有發(fā)生明顯的變化，也沒有出現(xiàn)Sub-G1峰。43°C，30min兩次加溫4種細(xì)胞種植腫瘤，其腫瘤相對(duì)體積曲線顯示，W細(xì)胞腫瘤生長比其他3種細(xì)胞腫瘤更明顯受到抑制（見圖3.2.2 ）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說明，野生型p53促進(jìn)了加溫所產(chǎn)生的細(xì)胞周期阻滯和凋亡，從而明顯地提高了腫瘤細(xì)胞的熱敏感性。

圖3.2.1 四種胃癌細(xì)胞43°C，30min后16h流式細(xì)胞分析圖

A、B、C、D為4種細(xì)胞在37°條件下16h，而E、F、G、H為43°C，30min后16h所顯示的G0/G1、S、G2/M期峰的直方圖。只有E圖顯示W(wǎng)細(xì)胞在43°C，30min后16h，S期峰明顯增大和在G0/G1峰前出現(xiàn)明顯的Sub－G1峰，預(yù)示凋亡出現(xiàn)。

表3.2.1 W細(xì)胞和M細(xì)胞細(xì)胞周期各時(shí)相和凋亡的比例

只有W細(xì)胞在兩種加溫后8或16小時(shí)，S期比例明顯增加，并出現(xiàn)明顯的凋亡分別為10.5%和12.3%。

圖3.2.2 43°C,20min，2次加溫后四種細(xì)胞種植腫瘤抑制曲線

顯示只有W細(xì)胞腫瘤受到明顯抑制，到20天時(shí)僅增大了1倍，

而其他3種細(xì)胞腫瘤到20天時(shí)增大了2.7~3.6倍，生長速度顯著地高于W細(xì)胞。

以上4種細(xì)胞感染腺病毒攜帶p53基因 (Adp53) 懸液，如果采用MOI（multiplicity of infection ）100的病毒劑量,可以達(dá)到細(xì)胞100％感染率和p53蛋白在細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)，并產(chǎn)生細(xì)胞周期G2/M期阻滯和凋亡以及細(xì)胞增殖抑制。Adp53基因的作用不依賴于細(xì)胞內(nèi)在p53狀態(tài)。如果以凋亡作為熱效應(yīng)，Adp53基因感染W(wǎng)細(xì)胞或M細(xì)胞2天后結(jié)合兩種加溫（42°C，2h或43°C，30min）后，Adp53的熱增效比，對(duì)W細(xì)胞為1.6~3.3,而對(duì)M細(xì)胞為1.8~2.1。W和M細(xì)胞裸鼠后肢種植腫瘤內(nèi)注射Adp53懸液2天后，行43°C，30min加溫，以腫瘤相對(duì)體積曲線顯示，Adp53對(duì)W細(xì)胞腫瘤的熱增效比為1.16，而對(duì)M細(xì)胞腫瘤為1.21（12）。通過這種腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)入p53的方法是目前使用最多的基因?qū)�入的方法，我們的研究結(jié)果也證明：通過P53基因?qū)�入，可以有效地重建腫瘤細(xì)胞內(nèi)變異的p53基因，通過延遲G2/M期阻滯和增加凋亡，使腫瘤細(xì)胞熱敏感性明顯提高，起到熱增效的作用。今后我們將嘗試通過腫瘤內(nèi)注射Adp53懸液，結(jié)合熱療，來提高腫瘤的熱療療效。

增強(qiáng)治療基因在腫瘤細(xì)胞和組織中的表達(dá)來提高放療、熱療和化療的效應(yīng)，是目前關(guān)注的亮點(diǎn)。象p53基因?qū)�入的策略一樣，用腺病毒攜帶IL-12 ( interleukin-12)或TNFa感染細(xì)胞后42°C,30min加溫，使IL-12或TNFa在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)13600或6.8′105倍升高。腫瘤內(nèi)注射AD-IL-12后加溫使腫瘤生長明顯受抑制（14）。IL-12或TNFa都是適于熱誘導(dǎo)表達(dá)的基因，它們和熱療起協(xié)同的作用。

3.3  細(xì)胞凋亡

細(xì)胞死亡可以分為細(xì)胞壞死( necrosis ) 和細(xì)胞程序化死亡( PCD, programmed cell death)兩種類型，,后者又稱為凋亡( apoptosis )。該詞源于希臘語，原意為花瓣或樹葉的凋落。細(xì)胞壞死是指機(jī)體或細(xì)胞受到外界強(qiáng)烈的刺激，如物理的低氧、低溫或高溫，以及化學(xué)因素?fù)p傷時(shí)所發(fā)生的一種強(qiáng)烈而快速的被動(dòng)性的細(xì)胞死亡過程。最早的形態(tài)學(xué)特征變化是細(xì)胞發(fā)生腫脹，胞漿和細(xì)胞器都發(fā)生腫脹，細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜繼而破潰和消失，最終被水解酶、磷酸脂酶、蛋白酶等消化殆盡。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)先呈為絮狀，繼而整體胞核發(fā)生固縮、碎裂和溶解，其變化的基礎(chǔ)是細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)的變性進(jìn)而凝固，所以又被稱為凝固性壞死，在水解酶的作用下壞死組織迅速液化，又可稱為液化性壞死。1971年Kerr 提出了有別于壞死的另一種細(xì)胞“自殺性”死亡，稱為apoptosis。這是一種細(xì)胞主動(dòng)的，由各種生理或病理性因素誘發(fā)或抑制的，并受各種基因調(diào)控的編程化死亡過程。它的原意是指發(fā)育過程中，定時(shí)出現(xiàn)的生理性刺激導(dǎo)致的死亡，是機(jī)體為保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種自主性的清除過程,是機(jī)體內(nèi)的一種生理過程。與細(xì)胞壞死過程截然不同，細(xì)胞程序化死亡在形態(tài)學(xué)上具有獨(dú)特的改變。，細(xì)胞首先變圓，隨即與周圍細(xì)胞連接消失，微絨毛丟失，胞漿濃縮，染色質(zhì)則濃縮成大小不等的半月狀，并凝聚在核膜周邊，再裂解為小片段，核仁裂解，進(jìn)而細(xì)胞膜內(nèi)陷將細(xì)胞自行分割包裹，形成外有包膜的細(xì)胞凋亡小體( apoptosis body )。這些凋亡小體可被鄰近細(xì)胞所吞噬清除。細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)特征主要是細(xì)胞核內(nèi)的DNA被核酸內(nèi)切酶降解，產(chǎn)生若干大小不一的由180個(gè)堿基對(duì)的整倍數(shù)的寡核苷酸片段組成，如在瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)，能觀察到特征性梯狀DNA條帶圖譜 ( DNA ladder )。細(xì)胞凋亡過程有新的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成，因而也是需要能量的過程。細(xì)胞凋亡是單個(gè)細(xì)胞的事件，不發(fā)生炎癥反應(yīng)。凋亡起始于核內(nèi)DNA的斷裂，壞死起始于膜功能的改變，后期也發(fā)生細(xì)胞核內(nèi)DNA降解，兩種壞死以不同途徑和方式，最后“異途同歸”，都進(jìn)入后階段的繼發(fā)性死亡( secondary necrosis )。加溫和輻射、化療藥一樣，都引發(fā)細(xì)胞的凋亡，通過了解細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于增加熱療對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡效應(yīng)，無疑具有十分重要的意義。

凋亡過程：

細(xì)胞濃縮

核染色體濃聚成月牙形、裂解成DNA片段

細(xì)胞膜內(nèi)陷分割

包裹形成凋亡小體

小體被吞噬

壞死過程：

細(xì)胞腫脹、破裂

核染色體固縮、裂解

細(xì)胞降解、碎片被

吞噬

細(xì)胞程序化死亡的機(jī)制：

發(fā)生程序化死亡的細(xì)胞發(fā)生各種生物化學(xué)以及結(jié)構(gòu)的變化，最早的特征性變化即為細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的3～5倍的升高，繼而激活一些鈣離子依賴性蛋白酶類，如內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶 ( endogenous endonuclease )被激活，它從核小體（DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的基本組成單位）連接部位的DNA序列上切割開來，產(chǎn)生的DNA片段都是由180個(gè)堿基對(duì)的整倍數(shù)的寡核苷酸片段。除此之外，作為第二信使的環(huán)磷酸腺苷 ( cAMP )在細(xì)胞內(nèi)濃度升高，它通過蛋白激酶A ( PKA, protein kinase A ) 的介導(dǎo)，也參與誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的最終結(jié)果都是細(xì)胞染色質(zhì)DNA片段化特征性的降解，最后產(chǎn)生細(xì)胞碎片，形成凋亡小體，被單核－巨噬細(xì)胞、或上皮細(xì)胞，甚至為腫瘤細(xì)胞所吞噬和消化。DNA的片段化，實(shí)際上就是DNA雙鏈斷裂不能修復(fù)的最終結(jié)果，可能就是細(xì)胞的真正死因。

細(xì)胞程序化死亡是一種由基因表達(dá)調(diào)控的疾病或生理過程。細(xì)胞凋亡的調(diào)控基因主要分為兩大類：一類是促進(jìn)細(xì)胞程序化死亡的基因，又稱為細(xì)胞自殺基因 ( cell suicide gene ),其中細(xì)分為兩個(gè)亞類,即細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因 (apoptosis-promoting gene ) 和細(xì)胞增殖抑制基因 ( proliferation-suppressive gene )，另一類是促進(jìn)細(xì)胞生存的基因，又稱為細(xì)胞生存基因 ( cell survival gene ), 同樣也細(xì)分為兩個(gè)亞類，即細(xì)胞凋亡抑制基因 ( apoptosis-suppressive gene ) 和細(xì)胞增殖促進(jìn)基因 ( proliferation-promoting gene )。細(xì)胞的生存和死亡，就是這兩類基因正負(fù)調(diào)控最后平衡的結(jié)果。如果細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因表達(dá)水平占上風(fēng)，就決定了細(xì)胞的死亡，反之，如果細(xì)胞生存及其相關(guān)基因表達(dá)水平占上風(fēng)，就決定了細(xì)胞的生存。為了提高熱療對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡效應(yīng)，我們可以人工地提高細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因的表達(dá)或降低細(xì)胞凋亡抑制基因，作為熱療基因調(diào)控的新靶點(diǎn)，這是熱療結(jié)合基因治療的新策略。下面我們探討一下細(xì)胞凋亡調(diào)控的幾種主要基因以及它們的調(diào)控機(jī)制。（圖3.3.2）

p53抑癌基因是一種直接參與細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)基因，起促進(jìn)凋亡的作用。加溫可以刺激細(xì)胞內(nèi)p53基因的表達(dá)短暫升高。熱療誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程是受p53基因調(diào)控的，是一種p53依賴性的過程（4，5，6，7，8，9，10）。p53對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控可能與促進(jìn)細(xì)胞膜表面受體Fas/APO1的表達(dá)相關(guān)。頻發(fā)于癌細(xì)胞中的原癌基因Bcl-2基因的過表達(dá)，可以抑制野生型p53介導(dǎo)的細(xì)胞程序化死亡，表明bcl-2是一種細(xì)胞凋亡抑制因子，其抗凋亡機(jī)制可能與拮抗氧自由基等所引起的細(xì)胞氧化有關(guān)。Bcl-2也降低了加溫產(chǎn)生的凋亡效應(yīng)（11）。野生型p53通過其調(diào)節(jié)作用，即降低Bcl-2基因的表達(dá)和同時(shí)誘導(dǎo)bax基因（細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因）的表達(dá)水平升高，來誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。P53蛋白對(duì)于bax啟動(dòng)子具有直接的轉(zhuǎn)錄激活作用，最終使bax/bcl-2的比例升高是增加細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵。作為癌基因k-ras基因的產(chǎn)物p21/WAF1/ CIP1 蛋白，是細(xì)胞周期蛋白D激酶 （ CDK ）的抑制劑，可在轉(zhuǎn)錄水平上被p53激活，抑制細(xì)胞G1/S期的進(jìn)展，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡，加溫后也證實(shí)了p53上調(diào)WAF1而誘導(dǎo)凋亡的作用（8）。由此可以看出野生型p53是很重要的凋亡轉(zhuǎn)錄因子，也是凋亡的效應(yīng)因子，如果p53發(fā)生變異，將失去以上功能，反而成為抑制凋亡的癌基因，突變型p53存在于50%以上人類腫瘤，這是腫瘤細(xì)胞熱反應(yīng)性降低的基因基礎(chǔ)。

除了bcl-2之外，在生長因子缺少的條件下，原癌基因 ( proto-oncogene ) c-myc的表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。加溫誘導(dǎo)腫瘤壞死因子a ( TNFa) 表達(dá)增加， TNFa對(duì)凋亡起促進(jìn)作用。

加溫后誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，有一個(gè)引發(fā)、發(fā)展、高峰、減弱的過程，與加溫溫度和加溫時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系。對(duì)于攜帶野生型p53的細(xì)胞，加溫后p53表達(dá)增加，對(duì)加溫引導(dǎo)的凋亡效應(yīng)起促進(jìn)作用，對(duì)于攜帶突變型p53的細(xì)胞，加溫后突變型p53表達(dá)也增加，與加溫產(chǎn)生的熱休克蛋白70協(xié)同，對(duì)加溫引導(dǎo)的凋亡效應(yīng)起減弱作用（7，9）。

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(中華熱療學(xué)會(huì) )