多數沙眼根據乳頭、濾泡、上皮角膜炎、血管翳、角膜緣濾泡、Herbert小凹等特異性體征可以作出診斷。由于瞼結膜的乳頭增生和濾泡形成并非為沙眼所特有，因此早期沙眼的診斷在臨床病變尚不完全具備時較困難，有時只能診斷“疑似沙眼”，要確診須輔以實驗室檢查。WHO要求診斷沙眼時至少符合下述標準中的2條：

1.上瞼結膜5個以上濾泡。

2. 典型的瞼結膜瘢痕。

3. 角膜緣濾泡或Herbet小凹。

4. 廣泛的角膜血管翳。

除了臨床表現，實驗室檢查可以確定診斷。沙眼細胞學的典型特點是可檢出淋巴細胞、漿細胞和多形核白細胞，但細胞學檢查的假陽性率高。

結膜刮片后行Giemsa染色可顯示位于核周圍的蘭色或紅色細胞漿內的包涵體。改良的Diff-Quik染色將檢測包涵體的時間縮短為幾分鐘。熒光標記的單克隆抗體試劑盒檢測細胞刮片衣原體抗原、酶聯免疫測定、聚合酶鏈反應都有高度敏感和高特異性，但要求操作者較熟練的掌握操作技術，花費也昂貴。

沙眼衣原體培養需要放射線照射或細胞穩定劑(如放線菌酮)預處理，通常在生長48～72小時后用碘染色單層細胞，或通過特殊的抗衣原體單克隆抗體檢測，是重要的實驗室檢查，但技術要求高，不能廣泛應用。